RESUMEN
Resumen El objetivo de este estudio fue evaluar el cultivo de cepas de Acanthamoeba spp. en agua destilada estéril apirógena de uso farmacéutico. Se utilizaron dos cepas de genotipo T4 [un aislamiento de encefalitis granulomatosa amebiana (EGA) y una ambiental] y cepas correspondientes a los genotipos T5 y T15. Los quistes de cada una de las cepas se sembraron en placas de Petri con agar no nutritivo con diferentes soluciones (agua destilada estéril apirógena uso médico para preparaciones inyectables, agua destilada filtrada, medio Page) y combinados con suspensiones de Escherichia coli. Las placas se incubaron a 37 °C y se monitorearon diariamente durante 15 días para la detección de trofozoítos. El crecimiento se evaluó mediante examen microscópico directo. Cada cultivo contó con cuatro repeticiones para cada una de las cepas (n=96). En conclusión, se hallaron diferencias estadísticamente significativas en el crecimiento de las cepas por día. Las cepas T5 y T4 (encefalitis amebiana granulomatosa) desarrollaron mayor cantidad de trofozoítos en el primer día respecto de la cepa T15 (H=16,42; p=0,001). En el agua apirógena con E. coli se obtuvo un crecimiento igual a la solución de Page con E. coli (H=24,64; p=0,0001). No se hallaron diferencias estadísticamente significativas en la cantidad de trofozoítos obtenidos en agua apirógena con E. coli y solución de Page con E. coli en la cepa T4 (EGA) (U=4; p<0,05) pero sí en la cepa T4 ambiental (U=0; p<0,05).
Abstract The objective of this study was to evaluate the culture of strains of Acanthamoeba spp. in sterile apyrogenic distilled water for pharmaceutical use. Two T4 genotype strains [one isolate of granulomatous amebic encephalitis (GAE) and one environmental], a T5 and T15 genotype strains were used. The cysts of each of the strains were seeded in Petri dishes with non-nutritive agar with different solutions (pyrogenic sterile distilled water for medical use for injectable preparations, filtered distilled water, Page medium) and combined with Escherichia coli suspensions. Plates were incubated at 37 °C and monitored daily for 15 days for the detection of trophozoites. Growth was assessed by direct microscopic examination. Each medium culture counted four replicates for each of the strains (n=96). Concluding, statistically significant differences were found in the growth of the strains per day. Strains T5 and T4 (granulomatous amebic encephalitis) developed a greater number of trophozoites on the first day compared to strain T15 (H=16.42; p=0.001). In apyrogenic water with E. coli, a growth equal to Page's solution with E. coli was obtained (H=24.64; p=0.0001). No statistically significant differences were found in the amount of trophozoites obtained in apyrogenic water with E. coli and Page's solution with E. coli in strain T4 (GAE) (U=4; p<0.05), but significant differences were found in the environmental T4 strain (U=0; p<0.05).
Resumo O objetivo deste trabalho foi avaliar o cultivo de cepas Acanthamoeba spp. em água destilada apirogênica estéril para uso farmacêutico. Foram utilizadas duas cepas de genótipo T4 [um isolamento de encefalite granulomatosa amebiana (EGA) e uma ambiental], e cepas correspondentes aos genótipos T5 e T15. Os cistos de cada uma das cepas foram semeados em placas de Petri com ágar não nutritivo com diferentes soluções (água destilada estéril apirogênica para uso médico para preparações injetáveis, água destilada filtrada, meio Page) e combinados com suspensões de Escherichia coli. As placas foram incubadas a 37 °C e monitoradas diariamente durante 15 dias para detecção de trofozoítos. O crescimento foi avaliado através de exame microscópico direto. Cada cultura contou com quatro réplicas para cada uma das cepas (n=96). Em conclusão, diferenças estatisticamente significativas foram encontradas no crescimento das cepas por dia. As cepas T5 e T4 (encefalite amebiana granulomatosa) desenvolveram maior número de trofozoítos no primeiro dia em relação à cepa T15 (H=16,42; p=0,001). Em água apirogênica com E. coli, foi obtido crescimento igual ao da solução de Page com E. coli (H=24,64, p=0,0001). Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas na quantidade de trofozoítos obtidos em água apirogênica com E. coli e solução de Page com E. coli na cepa T4 (EGA) (U=4; p%<0,05), mas sim na cepa T4 ambiental (U=0; p<0,05).
RESUMEN
Resumen El objetivo del estudio fue comparar la extracción de ADN de quistes de Acanthamoeba sp. con un método disponible comercialmente y cuatro no comerciales utilizando tratamiento térmico y ultrasonido para la amplificación por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional, reduciendo tiempos de preparación y extracción de las muestras, como una herramienta para el diagnóstico en el laboratorio clínico. Se utilizó una cepa de Acanthamoeba, genotipo T4, cultivada en agar no nutritivo. Los quistes para analizar, en tres períodos de enquistamiento, se almacenaron a temperatura ambiente. Se extrajo ADN mediante cinco métodos: pretratamiento térmico, ultrasonido y combinaciones de ellos. La PCR se llevó a cabo utilizando cebadores específicos JDP1/JDP2. La concentración y pureza del ADN extraído con los protocolos evaluados revelaron diferencias estadísticamente significativas (p<0,0001). El método E (comercial), el A (térmico) y el B (ultrasonido) lograron los mejores rendimientos en la amplificación del fragmento específico de Acanthamoeba sp. por la PCR convencional.
Abstract The objective of the study was to compare the DNA extraction of Acanthamoeba sp. cysts with a commercially available method and four non-commercial ones, with heat and ultrasound treatment that allows amplification by conventional polymerase chain reaction (PCR), reducing sample preparation and extraction times, such as a tool for diagnosis in the clinical laboratory. To this aim, a strain of Acanthamoeba T4 grown on non-nutrient agar was used. Plates with cysts at three different encystation times were stored at room temperature until the study was carried out. DNA was extracted with five methods that included pretreatments (thermal and ultrasound) or combinations of them. PCR was performed using specific primers JDP1/JDP2. Concentration and purity of DNA revealed statistically significant differences (p<0.0001) between methods. Method E (commercial), method A (thermal) and B (ultrasound) got the best yields in amplifying the specific fragment of Acanthamoeba sp. by conventional PCR.
Resumo O objetivo do estudo foi comparar a extração de DNA de cistos de Acanthamoeba sp. com um método comercialmente disponível e quatro não comerciais utilizando tratamento térmico e ultrassom para amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional, reduzindo os tempos de preparo e extração das amostras, como ferramenta para o diagnóstico no laboratório clínico. Foi utilizada uma cepa de Acanthamoeba, genótipo T4, cultivada em ágar não nutritivo. Os cistos para analisar foram armazenados em temperatura ambiente, correspondendo a três períodos de encistamento. O DNA foi extraído por cinco métodos: pré-tratamento térmico, ultrassom e combinações deles. A PCR foi realizada usando iniciadores específicos JDP1/JDP2. A concentração e a pureza do DNA extraído com os protocolos avaliados revelaram diferenças estatisticamente significativas (p<0,0001). Os métodos E (comercial), A (térmico) e B (ultrassom) alcançaram os melhores rendimentos na amplificação do fragmento específico de Acanthamoeba sp. por PCR convencional.